Decifrando o código genético

Depois de propor o modelo da estrutura tridimensional do DNA e sabendo que esta era a molécula da hereditariedade da célula, Francis Crick e James Watson propuseram que a seqüência de nucleotídeos da molécula provavelmente funcionava como um código, capaz de direcionar a síntese de proteínas. Crick propôs o “Dogma Central”, em que a informação genética "fluía" do DNA para a proteína através de uma molécula carreadora, o ácido ribonucléico – RNA (molécula fita simples, formada por nucleotídeos que contém em um esqueleto de açúcar-fosfato, ribose ao invés de desoxirribose e uracila no lugar da timina). A informação contida no DNA seria primeiro traduzida em RNA e depois transcrita em proteínas. Inicialmente esta proposição foi muito bem aceita mas pouco se sabia sobre a natureza do código genético, os eventos da transcrição e da tradução, os mecanismos de controle e as especificidades de funcionamento do próprio DNA. O próprio Crick achava razoável que a transcrição acontecesse seguindo os mesmos princípios da replicação mas como a tradução seria possível? Como os aminoácido interagiam com o RNA? Ele acreditava na existência de "moléculas adaptadoras" que ajudariam no processo. Na década de 50, Zamecnik desconhecia o Dogma Central ou a hipótese adaptadora de Crick, e abordou o problema sob um ponto de vista bioquímico. Ele fez um extrato usando células de fígado de rato e mostrou que esse extrato tinha tudo que era necessário para produzir proteínas num tubo de ensaio. No experimento, aminoácidos marcados radiativamente foram misturados ao extrato obtido anteriormente. A amostra foi incubada a temperatura adequada por um determinado intervalo de tempo e subsequentemente centrifugada. Esperava-se que os polipetídeos recentemente feitos, sendo mais pesados devido aos aminoácidos radioativos, ficassem no fundo do tubo. Os aminoácidos não radioativos, sendo mais leves, permaneceriam flutuando na solução. Foi identificada uma estrutura celular grande,depois chamada de ribossomo, misturada com os polipeptídeos radiativos no precipitado. Estava claro que o ribossomo (formado por proteínas e RNA ribossomal) era a organela citoplasmática envolvida na montagem das proteínas. Mahlon Hoagland começou a trabalhar no laboratório de Paul Zamecnik em 1953, procurando descobrir como os aminoácidos eran ativados, ou energizados, antes de se organizarem para formar uma proteína. Ele identificou as enzimas aminoacil tRNA sintetases que eram as responsáveis por ligar um aminoácido específico a um RNA transportador específico. Em 1955, Hoagland, Zamecnik e Mary Stephensen acharam, para surpresa de todos, que os aminoácidos são primeiro fixados num RNA de peso molecular baixo e solúvel e eram subseqüentemente transferidos para as proteínas nos ribossomos. A esse RNA carreador, foi dado o nome de RNA “solúvel”. Numa visita ao laboratório de Zamecnik, James Watson reconheceu que o RNA solúvel encaixava-se perfeitamente na hipótese adaptadora de Crick. Cada um dos RNAs solúveis podia conectar-se ao seu aminoácido correspondente e transportar seu aminoácido para o ribossomo para a síntese protéica. O RNA solúvel foi depois renomeado RNA transportador (RNAt) para que sua função fosse melhor reconhecida. As informações começavam a se acumular mas as "peças do quebra-cabeça" ainda não se encaixavam direito..... Como o código genético instruía o RNA transportador no citoplasma para a síntese das proteínas? Qual era o papel exato dos ribossomos? Qual era o RNA informativo? Enquanto muitos pensavam que o RNA ribossomal era o modelo em que se baseava a construção das proteínas, os estudos de Sydney Brenner, François Jacob e Matthew Meselson e de Fraçois Gros, James Watson e Walter Gilbert mostraram que esta molécula não tinha as propriedades informativas adequadas e não era o molde para a construção das proteínas. Havia um terceiro tipo de RNA, uma molécula intermediária instável, que levava a mensagem do DNA para o ribossomo. Esta molécula era produzida a partir de um molde de DNA e continha a transcrição da informação genética na seqüência de suas bases nitrogenadas, e portanto, continha a mensagem do DNA. Por isso foi denominada RNA mensageiro (RNAm) O grupo de Gobind Khorana e Marshall Nirenberg finalmente decifrou o código genético. Eles descobriram como a linguagem dos nucleotídeos do RNAm era traduzida na linguagem de aminoácidos das proteínas. Os dados obtidos por Crick e outros cientistas mostraram que um grupo de três nucleotídeos formavam um códon. Isso, teoricamente, fazia sentido, pois um códon feito de um ou dois nucleotídeos não poderia produzir combinações suficientes para codificar todos os 20 aminoácidos conhecidos (ex.: 1 nucleotídeo = 4 códons possíveis; 2 nucleotídeos = 4 x 4 códons possíveis; 3 nucleotídeos = 4 x 4 x 4 códons possíveis.). Mas um códon feito de três nucleotídeos produz 64 combinações. Isso produziria um código redundante, ou degenerado, onde muitos códons diferentes especificariam o mesmo aminoácido. Pelo princípio da parsimônia – na qual a solução mais simples geralmente é a correta – excluiu a hipótese do códon formado por quatro nucleotídeos Em 1961, Heinrich Matthaei e Nirenberg começaram os experimentos para testar a hipótese do códon triplo. Foi usado um extrato de uma célula qualquer de E.coli, pois eles acreditavam que esse extrato poderia conter todos os componentes necessários para traduzir RNAm em proteínas. O extrato foi tratado com DNase para destruir qualquer resto de DNA da E.coli – com isso não haveria o molde a partir do qual o RNAm seria produzido. Marianne Grunberg e Severo Ochoa produziram um RNA mensageiro sintético composto somente de uracila. Depois esse RNAm sintético foi adicionado ao extrato. Aminoácidos marcados radioativamente também foram colocados. Logo após colocar o extrato na centrífuga, o produto do mesmo foi examinado e foram encontrados polipeptídeos compostos só do aminoácido fenilalanina (PHE). A partir desse resultado, concluiu-se que uma seqüência de três uracilas – UUU – codificava o aminoácido fenilalanina. Um os 64 códons triplos havia sido determinado. O mesmo foi feito utilizando-se seqüências repetidas de outras bases. O RNAm feito somente de citosina (poli-C) dá origem a uma cadeia contendo só prolina (PRO), enquanto o poli-A faz uma cadeia só de lisina (LYS). Curiosamente, nenhuma proteína é codificada com o poli-G. Nirenberg e outros pesquisadores rapidamente reconheceram o poder dessa abordagem. Usando modelos de RNAm contendo diferentes combinações de nucleotídeos. Abreviaturas dos aminoácidos: Phe = fenilalanina Leu = leucina Ile = isoleucina Met = metionina Val = valina Ser = serina Pro = prolina Thr = treonina Ala = alanina Tyr = tirosina His = hidtidina Gln = glutamina Asn = aspargina Lys = lisina Asp = ácido aspártico Glu = ácido glutâmico Cys = cisteína Trp = triptofano Arg = arginina Gly = glicina Stop – corresponde aos códons de parada. Phil Leder ajudou Nirenberg com o resto do código genético. A maioria dos códons era difícil de decifrar porque não era possível estabelecer a ordem desses códons bioquimicamente. Por exemplo, um trio com dois Gs e um C poderia apresentar três ordens: CGG, GCG e GGC. Nirenberg e Leder usaram o RNAt para resolver esse problema. O RNA transportador é a molécula que carrega os aminoácidos para os ribossomos para a síntese de proteínas. Em 1962, Robert Holley apresentou a estrutura do RNAt. Ao mesmo tempo que o RNAt é uma única fita, trechos de nucleotídeos complementares formam ligações de hidrogênio, fazendo que estas regiões sejam dupla-fita, as quais dobram o RNAt deixando-o com um formato de uma folha de trevo de quatro folhas. Holley mostrou ainda que todos os RNAs transportadores têm estruturas similares.Na extremidade de uma das “folhas”, uma seqüência de três nucleotídeos forma um anticódon, que interage com um códon específico do RNAm. Assim, há diferentes moléculas de RNAt correspondentes a cada códon de RNAm. Usando o sistema de tradução in vitro, Zamecnick e seu grupo mostraram que o RNAt é ativado quando os aminoácidos ligam-se a base do RNAt. Esse passo requer energia química na forma de ATP. Primeiro foram feitas pequenas cadeias de RNA compostas de três ou seis nucleotídeos. Quando o extrato de uma célula qualquer foi adicionado, um RNAt ativado irá ler essas seqüências de três ou seis nucleotídeos. Depois, Leder inventou um meio de separar o RNAt do aminoácido e identificá-lo. Todo o código genético foi confirmado através dessa abordagem.Também descobriu-se que a tradução começava com o códon AUG – somente com este códon –, e terminava nos códons de parada. Em resumo, o código genético foi completamente decifrado. Assim, o DNA é tanscrito numa molécula de RNAm complementar que, no citoplasma, se associa ao ribossomo. O código do RNAm é então traduzido numa cadeia polipeptídica. O códon AUG inicia a tradução. Um RNAt ativado carrega o primeiro aminoácido - metionina – para o ribossomo. O anticódon do RNAt liga-se ao códon AUG no RNAm. Como os dois RNAs são mantidos em posição, uma ligação peptídica é formada entre os aminoácidos. O segundo RNAt recebe a cadeia de proteína em crescimento e a metionina do primeiro RNAt é cedida. O processo vai se repetindo até um códon de pareda aparecer na "mensagem" e a tradução é interrompida. Os códons de parada não têm RNAt correspondente. O ribossomo se desassocia para ser reutilizado na tradução de outro RNAm.